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Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF

PROTEOMIC SOLUTIONS traite aussi des échantillons qui n'ont pas été séparés par électrophorèse 2D dans notre laboratoire.

Vous pouvez envoyer vos spots découpés, vos gels, vos membranes après électrotransfert, ou votre fraction collectée après HPLC ou FPLC pour l'analyse MALDI.

Il nous est, malgré tout, indispensable d'avoir des renseignements sur les échantillons destinés à l'analyse par spectrométrie de masse.

1.Renseignements sur l'échantillon

• En général, issu d'électrophorèse 1D ou 2D, ou de chromatographie.

• Dans tous les cas, l'échantillon doit être dans un tampon qui n'interfère pas avec la spectrométrie de masse. Il nous est indispensable de connaître la composition et les caractéristiques de l'échantillon (composition chimique du solvant, molarité, pH, concentration en protéine, ainsi que toute précision sur le type des protéines (ex : glycoprotéines) .

• Dans le cas de l'électrophorèse 2D, le gel peut être coloré au bleu de Coomassie ou au nitrate d'argent (sans fixation par le glutaraldéhyde), mais, dans ce cas, l'obtention de résultats demeure aléatoire.

• Les spots d'intérêts, repérés par le client, seront découpés manuellement ou par un automate (selon le nombre de spots à exciser). Si les spots sont excisés par le client, les fragments de gel doivent être desséchés avant le transport dans un tube Eppendorf qui servira à l'envoi postal (à l'aide d'un évaporateur de type SpeedVac pendant 30 minutes). Alternativement, ils peuvent être expédiés humides, mais congelés dans la Carboglace.

• Enfin, une autre alternative est d'effectuer un électrotransfert du gel sur une membrane sans coloration préalable du gel. La membrane ainsi blottée, colorée au bleu de Coomassie et séchée, peut aussi être envoyée par simple courrier postal.

En tout cas, il est indispensable d'analyser au moins 2 fragments découpés dans des zones extrêmes du gel en l'absence de spots protéiques (témoins négatifs).

Service PRO WB : Electrotransfert sur membrane.

 

2. Préparation des échantillons

• Les échantillons (spots séchés) sont réhydratés et lavés pour éliminer les excès de colorant.

• Une digestion par la trypsine (en présence du gel ou de la membrane) est ensuite effectuée pendant 16 heures, éventuellement en présence d'octyl glucoside, si l'on soupçonne la génération de peptides particulièrement hydrophobes.

• Après centrifugation, le surnageant du digestat est récupéré pour analyse. Une fraction du surnageant peut ensuite être dessalée par chromatographie sur phase inverse (Zip TipT) avant dépôt sur une plaque porte-échantillons. Lors de cette opération se crée un fichier informatique de description des échantillons pour garantir une bonne traçabilité.

• Les gels et les fractions non dessalés sont conservés pour une éventuelle extraction spécifique.

 

3. Analyse spectrométrique

• Introduction du porte-échantillons dans le spectromètre de masse MALDI TOF (PE Voyager DE-STR plusT) et transfert du fichier informatique de descriptions des échantillons depuis l'automate mélangeur vers le micro-ordinateur de contrôle du spectromètre de masse.

• Détermination de la taille des peptides trypsiques avec étalonnage externe.

• Comparaison des données de la masse obtenues expérimentalement avec celles provenant d'une digestion virtuelle des phases de lecture ouvertes de la banque génomique de l'organisme d'intérêt pour identification de la protéine.

• En cas d'indétermination, l'échantillon subit une analyse spectrométrique complémentaire qui repose sur des données de séquences acquises par fragmentation des peptides trypsiques dans le spectromètre de masse (PSD, post source decay, et/ou CID, collision induced fragmentation) ; l'identification résulte de données de séquence et de données de masse.

• Production d'un rapport d'analyse. En l'absence d'accès à la banque génomique de l'organisme d'étude, des comparaisons peuvent être effectuées avec des banques de données de séquences de protéines, mais l'existence putative de protéines paralogues et de modifications post-traductionnelles rend cette approche hasardeuse.
  

Service PRO MP : Spectrométrie de masse MALDI TOF avec identification. Comprenant : Trypsinolyse, spectrométrie de masse MALDI TOF et interprétation.

 

En complément de ce service, nous pouvons vous proposer l'analyse
de séquence par PSD/CID et interprétation

 

Si vous êtes intéressés, contactez-nous pour discuter ensemble de votre projet.