Analyse
de séquence N-terminale (Séquençage d'Edman)
Les protéines
destinées à être séquencées doivent
se trouver dans des conditions de milieu très restrictives pour
que la chimie d'Edman puisse se dérouler sans encombre. Il est
essentiel que les modes de préparation du matériel protéique
ou peptidique soient connus précisément avant le début
de l'analyse.
La technique de microséquençage
peut être réalisée à partir soit d'échantillons
en solution dans un milieu adéquat, soit d'échantillons
fixés sur une membrane de PVDF (polyvinylidène difluorure)
de type ProblottT. L'immobilisation sur PVDF peut être obtenue
de plusieurs façons, soit à partir de solution, soit par
(électro)transfert depuis un gel d'électrophorèse.
Il est fondamental
de connaître la quantité de protéine fournie (ou
la concentration de la solution) car, sans cette donnée, il n'est
pas possible de connaître le rendement initial de clivage, donc
de savoir si l'on est en train de séquencer la protéine
d'intérêt ou bien une impureté protéique contaminante,
lorsque l'échantillon possède une extrémité N-terminale
bloquée.
Si le N-terminal est
bloqué, son débloquage demande une étude longue
et improbable. C'est pourquoi nous ne nous engagerons pas dans cette
voie. En revanche, il est possible de pratiquer une endoprotéolyse,
de séparer les peptides ainsi obtenus et de les séquencer
individuellement pour obtenir des données de séquences
internes.
1. Échantillons
en solution
Sur le plan quantitatif,
pour une expérience et dans des conditions standards, il faut
au moins 1 picomole de protéine séquençable, soit
2 à 5 picomoles déposées (100 à 250 nanogrammes
de protéines de 50 kDa) pour une séquence N-terminale d'au
moins 10 résidus. Le nombre maximal de résidus déterminables
dépend de la pureté de la protéine, de sa quantité,
de son hydrophilicité et de l'enchaînement des acides aminés.
L'idéal est
que cette quantité de protéine parvienne dissoute dans
un tampon approprié (cf infra), à la concentration de 1
picomole par microlitre environ. Avec des quantités de matériel
aussi faibles, il y a un risque très important d'adsorption des
produits lyophilisés et d'impossibilité de redissolution.
Il est nécessaire de disposer de solutions contenues dans des
tubes de type Eppendorf.
Par tampon approprié,
il faut entendre un tampon volatil, c'est-à-dire, par exemple,
l'eau pure, une solution alcoolique, une solution d'acétonitrile,
d'acide acétique, voire d'acide trifluoroacétique ou encore
d'acétate d'ammonium. Les sels sont absolument exclus. Les tampons
tels que Tris-glycine sont définitivement rédhibitoires,
car contenant un acide aminé ou des fonctions amines en très
grande abondance relative. L'urée, le chlorure de guanidinium
et le SDS doivent aussi être évités.
Les meilleures méthodes
de préparation d'échantillon sont soit la chromatographie
liquide haute performance en phase inverse, soit la reprise d'une protéine
lyophilisée dans l'eau pure.
2. Séquençage à partir
d'échantillons fixés sur membrane
Le transfert sur membrane
permet de dessaler et de laver très efficacement un échantillon.
C'est aussi le moyen de récupérer une protéine à partir
d'un gel d'électrophorèse. Enfin, après fixation
sur membrane, il est facile de procéder à la protéolyse
d'une protéine (trypsinolyse).
Technique Prosorb:
permet, sans centrifugation et en un temps court, de débarrasser
une protéine d'agents chaotropes, de sels et de SDS, après
dilution éventuelle. Il convient d'aboutir à une quantité minimale
de protéine de 2 à 5 picomoles.
Électrotransfert : technique électrophorétique qui aboutit
au transfert de toutes les protéines d'un gel ni coloré ni fixé sur
une membrane ProblottT qui pourra ensuite être colorée (bleu de
Coomassie, rouge Ponceau, etc., mais pas de nitrate d'argent) avant découpe
des spots d'intérêt. C'est la méthode la plus sensible et
la meilleure pour alimenter un séquenceur d'Edman.
Transfert passif : peut être obtenu avec une bande ou un spot électrophorétique
coloré au bleu de Coomassie, mais avec un rendement qui entraîne
une perte de matériel, donc une baisse de sensibilité. Cette
technique demande 72 heures d'incubation.
Pour déterminer
la séquence N-terminale d'une protéine contenue dans
une bande ou un spot électrophorétique, la méthode
de choix est l'électrotransfert d'un gel ni fixé ni coloré,
suivi de la coloration de la membrane au bleu de Coomassie.
Si le gel a été initialement coloré au bleu de Coomassie,
on peut procéder à un transfert passif du fragment de gel, ou,
après broyage du spot, à une récupération de la
protéine par HPLC ou encore par la technique Prosorb. En aucun cas on
ne peut utiliser un gel coloré au nitrate d'argent.
3. Remarque
importante
La fourniture détaillée
de toutes les informations que possède le demandeur sur la protéine à séquencer,
notamment l'objectif recherché, est indispensable à la
bonne mise en ouvre du séquençage. Ces informations guideront
les choix méthodologiques et optimiseront les coûts.
Service PRO EDMAN :
Séquence chimique N terminal
Si vous êtes intéressés, contactez-nous pour discuter ensemble de votre projet. 
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